Abubuwan da ke haifar da tsangwama a cikin halayen PCR

A lokacin amsawar PCR, ana samun wasu abubuwan da ke kawo cikas.
Saboda yawan tasirin PCR, gurɓatawa yana ɗaya daga cikin mahimman abubuwan da ke shafar sakamakon PCR kuma yana iya haifar da sakamako mai kyau na ƙarya.
Haka nan ma mahimman hanyoyin da ke haifar da sakamako marasa kyau. Idan aka hana ko aka yi katsalandan a cikin ɗaya ko fiye da muhimman sassan PCR ko kuma amsawar ƙara girman jiki, gwajin ganewar asali zai iya kawo cikas. Wannan na iya haifar da raguwar inganci har ma da sakamakon marasa kyau na ƙarya.
Baya ga hanawa, asarar ingancin sinadarin nucleic acid na iya faruwa saboda yanayin jigilar kaya da/ko ajiya kafin shirya samfurin. Musamman ma, yanayin zafi mai yawa ko rashin isasshen ajiya na iya haifar da lalacewar ƙwayoyin halitta da ƙwayoyin nucleic acid. Daidaita ƙwayoyin halitta da kyallen jiki da saka paraffin sanannu ne ke haifar da rarrabuwar DNA da kuma matsala mai ɗorewa (duba Hoto na 1 da 2). A cikin waɗannan yanayi, ko da mafi kyawun keɓewa da tsarkakewa ba zai taimaka ba.

Hoto na 1 | Tasirin hana motsi akan ingancin DNA
Electrophoresis na gel na Agarose ya nuna cewa ingancin DNA da aka ware daga sassan paraffin na gawarwakin mutum ya bambanta sosai. DNA na matsakaicin tsayin guntu daban-daban yana nan a cikin abubuwan da aka cire dangane da hanyar gyarawa. Ana adana DNA ne kawai lokacin da aka gyara shi a cikin samfuran daskararre na asali da kuma a cikin formalin tsaka tsaki. Amfani da formalin mai ƙarfi mai acidic Bouin ko wanda ba a buffered ba, mai ɗauke da formalin mai ɗauke da acid ya haifar da asarar DNA mai yawa. Sauran ɓangaren yana da rauni sosai.
A gefen hagu, ana nuna tsawon gutsuttsuran a cikin nau'i-nau'i na kilobase (kbp)

Hoto na 2 | Asarar ingancin abubuwan da ke haifar da sinadarin nucleic acid
(a) Rata tsakanin 3′-5′ a kan zare biyu zai haifar da karyewar DNA da aka nufa. Har yanzu ana samun haɗin DNA a kan ƙaramin guntu. Duk da haka, idan wurin da aka yi amfani da primer a cikin guntu na DNA ya ɓace, ƙara girman layi ne kawai ke faruwa. A cikin mafi kyawun yanayi, gutsuttsuran na iya sake cika juna, amma yawan amfanin zai kasance ƙanana kuma ƙasa da matakan ganowa.
(b) Asarar tushe, galibi saboda rashin tsarki da samuwar thymidine dimer, yana haifar da raguwar adadin H-bonds da raguwar Tm. A lokacin tsawaita lokacin ɗumamawa, primers za su narke daga matrix DNA kuma ba za su yi annual ba ko da a ƙarƙashin yanayi mara tsauri.
(c) Tushen thymine da ke kusa da su suna samar da dimer TT.
Wata matsala da ta fi faruwa a binciken kwayoyin halitta ita ce sakin ƙwayoyin nucleic acid da ba su da kyau idan aka kwatanta da cirewar phenol-chloroform. A cikin mawuyacin hali, ana iya danganta wannan da rashin sakamako na ƙarya. Ana iya adana lokaci mai yawa ta hanyar tafasa lysis ko narkewar tarkacen ƙwayoyin halitta, amma wannan hanyar sau da yawa tana haifar da ƙarancin amsawar PCR saboda rashin isasshen sakin ƙwayoyin nucleic acid.

Hana aikin polymerase yayin haɓakawa

Gabaɗaya, hanawa ana amfani da shi azaman ra'ayin kwantena don bayyana duk abubuwan da ke haifar da sakamakon PCR mara kyau. A ma'anar sinadarai masu mahimmanci, hanawa yana iyakance ga aikin enzyme, watau, yana rage ko hana canza samfurin substrate ta hanyar hulɗa da wurin aiki na DNA polymerase ko cofactor (misali, Mg2+ don Taq DNA polymerase).
Abubuwan da ke cikin samfurin ko wasu abubuwan da ke ɓoyewa da abubuwan da ke ɗauke da sinadarai na iya hana enzyme kai tsaye ko kuma su kama abubuwan haɗin gwiwa (misali EDTA), ta haka suna hana polymerase aiki kuma hakan yana haifar da raguwa ko sakamakon PCR mara kyau.
Duk da haka, hulɗa da yawa tsakanin abubuwan da ke cikin amsawa da kuma nucleic acid masu ɗauke da manufa ana kuma sanya su a matsayin 'masu hana PCR'. Da zarar an wargaza amincin tantanin halitta ta hanyar warewa kuma aka saki nucleic acid, hulɗa tsakanin samfurin da maganin da ke kewaye da shi da kuma matakin ƙarfi na iya faruwa. Misali, 'masu ɓoyewa' na iya ɗaure DNA mai ɗaure ɗaya ko biyu ta hanyar hulɗar da ba ta da haɗin kai kuma suna tsoma baki ga warewa da tsarkakewa ta hanyar rage adadin abubuwan da ake hari da su a ƙarshe su isa ga jirgin ruwan amsawar PCR.
Gabaɗaya, masu hana PCR suna nan a cikin yawancin ruwan jiki da abubuwan da ake amfani da su don gwaje-gwajen asibiti (urea a cikin fitsari, haemoglobin da heparin a cikin jini), ƙarin abinci (abin da ke cikin sinadarai na halitta, glycogen, mai, ions na Ca2+) da abubuwan da ke cikin muhalli (phenols, ƙarfe masu nauyi)

Ana iya samun ƙarin masu hana PCR a cikin ƙwayoyin cuta da ƙwayoyin eukaryotic, DNA mara manufa, ƙwayoyin macromolecules masu ɗaure DNA na matrices na nama da kayan aikin dakin gwaje-gwaje kamar safar hannu da robobi. Tsarkakewar ƙwayoyin nucleic acid yayin ko bayan cirewa ita ce hanya mafi kyau don cire masu hana PCR.
A yau, kayan aikin cirewa ta atomatik daban-daban na iya maye gurbin yarjejeniyoyi da yawa na hannu, amma ba a taɓa cimma nasarar murmurewa da/ko tsarkakewa 100% na abubuwan da aka nufa ba. Masu hana masu yuwuwar har yanzu suna nan a cikin tsarkakakkun ƙwayoyin nucleic acid ko kuma sun riga sun fara aiki. Akwai dabaru daban-daban don rage tasirin masu hana. Zaɓin polymerase mai dacewa na iya yin tasiri mai mahimmanci akan ayyukan masu hanawa. Sauran hanyoyin da aka tabbatar don rage hana PCR sune ƙara yawan polymerase ko amfani da ƙari kamar BSA.
Ana iya nuna hana halayen PCR ta hanyar amfani da tsarin kula da ingancin tsari na ciki (IPC).
Dole ne a yi taka-tsantsan wajen cire dukkan sinadaran da sauran maganguna a cikin kayan cirewa, kamar ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol da phenol, daga sinadarin nucleic acid ta hanyar wankewa sosai. Dangane da yawansu, suna iya kunna ko hana PCR.